Carlo Maderno, Girolamo e Carlo Rainaldi, Francesco Borromini, hanno contribuito, nel corso di circa un secolo, alla definitiva sistemazione del palazzo. Sorto sui resti delle terme neroniane, l'edificio fu venduto nel 1590 da Monsignor Andrea Vento al Marchese Vincenzo Giustiniani.

I Giustiniani, rappresentanti della grande aristocrazia mercantile genovese, inventori delle società per azioni, stabilitisi a Roma fecero del palazzo la residenza di famiglia, oltre che il luogo in cui raccogliere l'immensa collezione d'arte che contava oltre 1800 statue antiche, alcune delle più importanti opere dei pittori del Seicento e numerose tele di Caravaggio. Nella biblioteca dell'edificio, oggi residenza del Presidente del Senato, fu firmata la Costituzione della Repubblica Italiana nel 1947.